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Sulfo Cyanine3 Maleimide使用说明实验方案

一、产品简介

 

Sulfo-Cyanine3 Maleimide是硫醇反应性染料，用于标记巯基。常被用于生物分子标记，荧光成像及其他荧光生物分析。Cy3在与蛋白质结合后增强荧光，用于标记肽、蛋白和核酸。

 

中文名称：磺化Cy3-马来酰亚胺；水溶Cy3-马来酰亚胺
英文名称：Sulfo-Cyanine3 Maleimide；Sulfo-Cy3 maleimide；Sulfo-Cyanine3 mal
CAS号：1656990-68-9
分子式：C36H41KN4O9S2
分子量：776.96
Ex (nm)：555
Em (nm)：569
纯度：95%+
规格：1mg、5mg、10mg、25mg（也可提供g或kg级供应）
储存条件：-20℃，干燥，避光保存，避免频繁冻融，建议现配现用。
新研博美结构式：

二、产品优势

 

水溶性好

消光系数高

摩尔吸收率大

高特异性和灵敏度

 

三、实验方案

 

1.溶液配制

（1）蛋白质储备溶液（溶液A）

 

将100µL反应缓冲液（例如pH~6.0的100mM MES缓冲液）与900µL蛋白溶液（例如抗体，蛋白质浓度>2 mg/mL）混合，制成1mL蛋白质标记储备溶液。

注意：蛋白质溶液（溶液A）的pH值应为6.5±0.5。

注意：不纯的抗体或用牛血清白蛋白（BSA）或其他蛋白稳定的抗体不能很好地被标记

注意：蛋白质浓度低于2mg/mL，偶联效率会显著降低。为了获得好的标记效率，建议最终蛋白质浓度范围为2-10mg/mL。

 （2）染料储备溶液（溶液B）

 

将无水DMSO加入Cy3 马来酰亚胺小瓶中，制成10mM储备溶液。通过移液或涡旋混合均匀。

注意：开始偶联之前准备染料储备溶液（溶液B）并及时使用。染料储备溶液长时间储存可能会降低染料活性。溶液B在避光和防潮的情况下可以在冰箱中储存4周。避免反复冻融。

（3）可选

 

如果您的蛋白质不含游离半胱氨酸，则必须用 DTT 或 TCEP 处理蛋白质生成硫醇基团。 DTT 或 TCEP 将二硫键转化为两个游离硫醇基团。如果使用 DTT，则必须在马来酰亚胺染料与蛋白质结合之前，通过透析或凝胶过滤除去游离 DTT。以下是生成游离硫醇基团的示例方案：

1>.在蒸馏水中制备 1M DTT (15.4 mg/100 µL) 的新鲜溶液。

2>.在 20 mM DTT 中制备 IgG 溶液：混合时每 ml IgG 溶液添加 20 µL DTT储备液。在室温下静置 30 分钟，无需额外混合（以尽量减少半胱氨酸再氧化为胱氨酸）。

3>.将还原的 IgG 通过用“交换缓冲液”预平衡的过滤柱。从柱中收集 0.25 mL 馏分。

4>.确定蛋白质浓度并将大部分 IgG 的组分合并。可以通过分光光度法或比色法来完成。

此步骤后尽快进行缀合（参见示例实验方案）。

注意： 为了获得好的结果，IgG 溶液得浓度应 >4 mg/mL。如果抗体低于 2 mg/mL，则应进行浓缩。另外，需要增加 10% 来补偿在缓冲液交换柱上的损失。

注意：还原反应可以在 pH 7-7.5 的任何缓冲液中进行，例如 MES、磷酸盐或 TRIS 缓冲液。

注意：步骤3>.和4>.可以用透析代替。

 

2.样品实验方案

 

（该方案适用于山羊抗小鼠IgG与Cy3 马来酰亚胺的偶联物标记。）

注意：每种蛋白质都需要不同的染料/蛋白质比，这也取决于染料的性质。蛋白质的过度标记可能会对其结合亲和力产生不利影响，而低染料/蛋白质比的蛋白质偶联物会降低灵敏度。

 

（1）进行偶联反应

 

1>.使用10:1的摩尔比率（溶液B（染料）/A（蛋白质））作为起点：将5µL染料储备溶液（溶液B，假设染料储备溶液为10 mM）加入蛋白质溶液（95µL溶液A）的小瓶中并充分摇晃。假设蛋白质浓度为10mg/mL，蛋白质分子量为~200KD，则蛋白质浓度为~0.05 mM。

注意：建议使用溶液B（染料）/溶液A（蛋白质）的摩尔比为10:1。如果太少或太高，可以尝试5:1、15:1和20:1来确定合适的染料/蛋白质比。

2>.在室温下继续旋转或摇动反应混合物30-60分钟。

 

（2）纯化偶联

 

（以下方案是使用Sephadex G-25柱纯化染料蛋白偶联物的一个例子）

1>.按照产品说明准备Sephadex G-25柱。

2>.将“进行偶联反应”步骤中的反应混合物装入Sephadex G-25柱的顶部。

3>.当样品刚低于顶部树脂表面时，立即加入PBS（pH 7.2-7.4.）。

4>.向样品中加入更多的PBS（pH 7.2-7.4）完成柱子纯化。将含有目标染料-蛋白质缀合物的组分合并。

注意：如果需要立即使用，染料-蛋白质缀合物物需要用染色缓冲液稀释，并分装。

注意：为了长期储存，染料蛋白缀合物溶液需要浓缩或冷冻干燥。

 

编辑于2025.03.12
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