AF647-Maleimide使用说明书

1. 一般性质
中文名称：AF647 马来酰亚胺
英文名称： AF647 Maleimide，Alexa Fluor 647 Maleimide，AF647 Mal，Alexa Fluor 647 Mal，AF647 C2-Maleimide
CAS号：1825332-75-9
分子式：C60H97N7O15S4
分 子 量: 1284.71
消光系数: 265,000 cm-1M-1
新研博美结构式&光谱图：

2. 产品描述
AF647-Maleimide是一种明亮且光稳定的近红外染料，在光谱上类似于Cy5染料。AF647-Maleimide是完全水溶性的，通常选择用于标记抗体和肽。是标记对有机辅助溶剂敏感的抗体、肽和蛋白质的试剂。AF647偶联物对pH值不敏感，在pH值4到10范围内稳定。在这种长波长染料光谱区域内，生物样本产生的自发荧光很小。这种长波长染料的荧光对人眼来说是不可见的，但很容易被大多数成像系统检测到。
马来酰亚胺是受欢迎的巯基反应性基团，用于将染料与蛋白质、寡核苷酸硫代磷酸酯或低分子量配体上的硫醇基团结合。马来酰亚胺基团在pH值为6.5至7.5时与还原硫醇（巯基，-SH）发生特异性的反应，形成稳定的硫醚键。
3. 储存条件
-20℃干燥避光保存，至少稳定6个月
4. 标记方案
以下是标记IgG抗体的典型方案。除纯化程序可能需要修改，标记其他含硫醇分子的方案是相似的。标记反应可以按比例放大或缩小任何量的蛋白质，只要保持试剂的比例即可。
1. 标记步骤
1.1 准备用于标记的抗体溶液
a)在室温下将抗体以50-100uM（IgG为7.5-15mg/mL）的浓度溶解在材料部分列出的任何缓冲液中。
b)作为一个可选的步骤，如果你希望从蛋白质的二硫键中释放出更多的硫醇基团，你可以在这个阶段加入~10倍摩尔过量的TCEP。将反应溶液孵育约30分钟。还原反应和随后的标记反应最好在惰性气体（N2或Ar）存在下进行，以防止二硫键的重新形成。
1.2 配制染料原液
将AF647-Maleimide恢复至室温。加入无水DMSO制备10mM染料原液。进行短暂的漩涡混匀以完全溶解染料，然后进行短暂的离心确保染料在样品管底部。
注意:
1.如果标记反应是用少量蛋白质进行的，则染料原液可能需要稀释来保证精准取量。
2.未使用的染料原液可以在-20℃的温度下干燥避光储存。如果使用无水二甲基亚砜制备溶液，则染料应至少稳定一个月。
1.3 进行标记反应
a)在搅拌或涡旋蛋白质溶液的同时，加入一定体积的染料溶液，使染料与蛋白质的摩尔比为10-20。例如，对于50μM的IgG，您可以将染料添加到0.5-1mM的最终浓度。
b)在室温避光下继续搅拌或摇动反应溶液2小时或4℃下过夜。
1.4 从标记的蛋白质中分离游离染料
a) 制备在PBS缓冲液（pH~7.4）中平衡的Sephadex®脱盐柱（10 mm x 300mm）。
b) 将来自步骤1.3b的反应溶液加载到柱上，并用PBS缓冲液洗脱柱。从柱中排出的第一条带是抗体偶联物。
c) 注意：对于小规模的标记反应，您可以使用超滤管从偶联物中去除游离染料以避免产品过于稀释。10K MWCO可用于IgG；具有不同分子量的蛋白质可能需要不同的MWCO。
2. 标记度（DOL）的测定
2.1 确定蛋白质浓度
抗体偶联物的浓度可由以下公式计算：
[conjugate] (mg/mL) = {[A280 - (Amax x Cf)]/1.4} x 稀释因子其中
[conjugate]是从柱中收集的抗体偶联物的浓度；
 “稀释因子”是用于光谱测量的稀释倍数；
 A280和Amax分别是偶联物在280nm处的吸光度读数和吸收最大值；
 Cf为吸光度校正系数；
 值1.4是以mL/mg为单位的IgG的消光系数。
注意:
1.蛋白质溶液可能过于浓缩，无法准确测量吸光度，因此须稀释至约0.1mg/mL。必要的稀释倍数（“稀释因子”）可以根据起始抗体浓度和收集的蛋白质溶液的总体积来估计。
2.如果标记IgG以外的蛋白质，则使用该特定蛋白质的消光系数。
2.2 计算标记度（DOL）
DOL根据以下公式计算：
DOL = (Amax x Mwt x稀释因子)/(ε x [conjugate])
其中Amax、“稀释因子”和[conjugate]如步骤2.1中所定义
Mwt是IgG的分子量（~150000）
ε是染料的摩尔消光系数
3.标记抗体的储存和处理
对于长期储存，我们建议将BSA和叠氮化钠添加到偶联物溶液中（最终浓度分别为5-10mg/mL和0.01-0.03%）以防止变性和微生物生长。偶联物溶液应储存在4℃并避光。
如果添加最终浓度>50%的甘油，则偶联物可以在-20℃下储存。在这些条件下，抗体偶联物可稳定一年或更长时间。