说明书-α-Bungarotoxin Conjugates （银环蛇毒素）

产品说明

                                                    α-Bungarotoxin Conjugates

储存和运输

储存于 -20°C 并避光，尤其是在溶液中。按建议储存时，产品自收到之日起至少可稳定保存 1 年。

可在 PBS 中配制 0.5 mg/mL 的储备溶液，并在 4°C 下保存至少 6 个月，或在 -20°C 下以单次使用的等分试样长期保存。避免多次冻融循环。

颜色和形态： 冻干固体或粉末，颜色因偶联物而异。溶解性：可溶于水或水性缓冲液。

光谱特性

吸收/发射最大值见上表。

产品说明

α-Bungarotoxin是一种来自某些蛇类毒液的强效多肽神经毒素，是神经肌肉接头处运动终板乙酰胆碱受体的抑制剂。α-bungarotoxin 的荧光偶联物可用于烟碱乙酰胆碱受体（AChRs）的成像。

α-Bungarotoxin 还可用于检测细胞中的 GABAA 受体亚群 (1)，或标记表达 α-bungarotoxin 结合位点 (BBS) 表位标签的重组蛋白 (2) 。陕西新研博美生物科技有限公司供应的CF染料是卓越的荧光染料，具有极高的亮度和光稳定性。我们还提供传统荧光染料 FITC、TRITC 和 Texas Red的偶联物。

生物素化的α-Bungarotoxin可用于使用抗生物素或链霉亲和素基质的烟碱类AChRs的亲和分离。用生物素XX-α-Bungarotoxin标记的烟碱类

AChRs也可以使用酶或荧光团标记的抗生物素或链霉亲和素偶联物进行定位。

陕西新研博美生物科技有限公司还提供非结合型 α-Bungarotoxin，可用于阻断胆碱受体以研究神经肌肉接头。

注：陕西新研博美生物科技有限公司的 α-Bungarotoxin包含两种大小相似的多肽（截留分子量：约 8,000 道尔顿），这两种多肽都能以同样高的亲和力和选择性与神经肌肉接头处的烟碱乙酰胆碱受体结合。出现两种多肽的原因尚不清楚，但可能与分离毒素的蛇类有关。

α-Bungarotoxin 也可用于脑组织切片染色。

参考文献

1) PNAS 103(13), 5149-5154 (2006); 2) Methods Enzymol 521, 109-129 (2013).

  图 1. 用 CF594 α-Bungarotoxin 染色的大鼠骨骼肌冷

 冻切片（红色）。用含 DAPl（细胞核，蓝色）的 

EverBrite™ 装片介质装片。

常规染色方案

以下是使用荧光α-Bungarotoxin 标记物对大鼠骨骼肌的 10 um厚的新鲜冷冻切片进行染色的示例操作规程，针对其他应用可能需要进行优化。对于组合免疫荧光和α-Bungarotoxin 染色，可以将α-Bungarotoxin 络合物与荧光标记的第二抗体一起孵

育。

1. 在室温下，将新鲜冷冻的切片在PBS 中的 4%多聚甲醛中固定 15 分钟。或者可以将切片在-20℃ 的冰冷甲醇中固定5 分钟。用PBS 冲洗3 次。

2. 在室温下用 PBS/0.1% Triton X-100 渗透切片10 分钟。甲醇固定的切片不需要透化

3. 制备PBS 中1ug/ml 的α-Bungarotoxin 染色溶液。偶联物也可以在免疫荧光封闭缓冲液中稀释。

4. 用足够的染色溶液覆盖切片以完全覆盖组织。可以将盖玻片放在染色溶液的顶部，将溶液均匀地铺在切片上

5. 在避光室温下孵育至少15 分钟

6. 在PBS 中冲洗几次

7. 安装在荧光防褪色介质和盖玻片中。

神经肌肉接头（NMJ）染色

神经肌肉接头可以通过光学显微镜在标记突触前神经末梢和突触后乙酰胆碱受体后进行可视化。为了获得最佳观察效

果，肌肉应进行纵向切片，并确保NMJs正面朝向。在几乎所有的肌肉中，终板带都接近肌肉的中部，这是需要重点观察的区域。

染色步骤如下：

1. 将肌肉放入2%多聚甲醛缓冲液中轻微固定，固定过程需在冰上进行，持续2-4小时。（注意：多聚甲醛应新鲜配制。过度固定或使用低质量   固定剂会降低或消除突触前蛋白的抗原性。）

2. 肌肉可以以多种方式制备用于染色，但切片时应定位纵向切片。

3. 使用冷冻切片机切割比较厚的冷冻切片（20-40微米厚度），或使用振动切片机切割50微米的未冷冻组织切片（去除肌腱以便于切片）可以   获得良好的结果。也可以直接在载玻片上分离肌纤维以获得单个纤维。

4. 然后使用标准的免疫细胞化学方案对样本进行染色。

5. 突触前抗原可使用抗神经丝蛋白（例如单克隆抗体2H3）和抗SV2混合标记，这样可以完全标记出轴突和神经末梢。

6. 突触后受体则使用高亮度、高特异性的α-bungarotoxin荧光偶联物进行标记。

7. 标准染色方案包括先用一抗孵育，然后洗涤，接着再用二抗和α-bungarotoxin混合物进行染色，之后再洗涤。这一过程需要耐心，例如可以   过夜使用一抗孵育，然后在第二天进行洗涤。

8. 可以使用标准抗体稀释缓冲液，这种缓冲液通常是含有BSA或正常山羊血清作为阻断剂的PBS，并且其中还包含大量的表面活性剂（0.5-1%  Triton X-100）。

9. 样本可以在标准荧光显微镜下观察，但鉴于样本的大尺寸和三维特性，使用共聚焦Z系列可以得到更清晰的观察结果。

10. 通过观察，可以很容易地发现许多缺陷，如部分神经支配或完全神经支配的突触后受体位点碎裂或萎缩、萎缩的轴突或末端、以及肿胀或   营养不良的轴突或末端。更细微的缺陷包括神经末端发芽和多个神经支配或突触位点（正常情况下，两周后应存在单个神经支配）。正常         的NMJ具有连续的卷饼状形态，AChR染色呈现斑马条纹外观（连接褶皱），神经末端完全重叠受体。

 如图1所示

注意事项包括肌肉间大小和形状的轻微差异，以及可能消除染色的固定伪影，特别是突触前。通常情况下，突触前末梢的缺陷，例如部分收缩，会在突触后受体中反映出较模糊的成像。

其他可以提供信息的应用分析包括用抗S100染色以可视化Schwann细胞（末端Schwann细胞在引导末梢发芽和再内源性中起重要作用（1,2）），以及用组织化学染色来可视化乙酰胆碱酯酶（3）。

图1：神经肌肉接头染色

在对照神经肌肉接头 (a) 中，神经 (使用抗神经丝加抗 SV2染成绿色，或使用 Thy1-YFP 转基因菌株) 完全与突触后AChR 重叠 (使用α-bungarotoxin荧光偶联物染成红色)。

(b) 部分神经支配的例子，其中萎缩的运动轴突和末端未能完全覆盖肌肉上的 AChR。

(c) 明显去神经支配的例子，其中在部分神经支配的部位 (双箭头) 附近观察到没有相关神经的突触后 AChR 部位 (箭头)。

(b) 和 (c) 是来自 Charcot-Marie-Tooth 2D [ 4 ] 的 GarsNmf249/+小鼠模型的例子。其他 NMJ 病理在来自未发表的自发突变的例子中很明显。轴突和末端具有不规则的直径和膨大（箭头），突触后部位是碎片（双箭头）。这些变化预示着最终的去神经支配。这些病理在非常老的小鼠（大于 15 个月）中也观察到，但在这个突变体中，3 个月大时就很明显了

参考文献

1. Son YJ, Thompson WJ (1995) Nerve sprouting in muscle is induced and guided by processes extended by Schwann

cells. Neuron 14:133 – 141

2. Son YJ, Thompson WJ (1995) Schwann cell processes

guide regeneration of peripheral axons. Neuron 14:125 – 132

3. Enomoto H, Araki T, Jackman A, Heuckeroth RO, Snider WD, Johnson EM Jr et al (1998) GFR alpha1-deficient

mice have deficits in the enteric nervous system and kidneys. Neuron 21:317 –324

4. Seburn, K. L., Nangle, L. A., Cox, G. A., Schimmel, P. and Burgess, R. W. (2006) An active dominant mutation of

glycyl-tRNA synthetase causes neuropathy in a Charcot- Marie-Tooth 2D mouse model. Neuron 51, 715-726.