FeRhoNox-1 (Fe2+indicator) 亚铁离子荧光探针保存方法及使用说明

FeRhoNox-1 (Fe2+indicator) 亚铁离子荧光探针

一、产品简介:
FeRhoNox-1，也称为RhoNox-1，是一种活跃的荧光探针，特异性检测不稳定的铁(II)离子（Fe2+）。一旦与Fe2+反应后，不可逆的生成一种橙色（红色）荧光产物（Absmax=540nm，FLmax=575nm，图1.FeRhoNox-1的光谱特征）。生理浓度下的铁（III）离子（Fe3+）或其它除铁离子以外的二价金属离子都不会使其荧光增强（见图2FeRhoNox-1的选择性）.FeRhoNox-1的反应特异性）。FeRhoNox-1具细胞膜渗透性和高选择性，适用于活细胞内Fe2+的检测，倾向定位在高尔基体。

图1. FeRhoNox-1的光谱特征。FeRhoNox-1与Fe2+反应后吸收和发射光谱（上）。FeRhoNox-1在37℃，与Fe2+反应1h后，荧光明显增强。最大荧光峰约在575nm。

图2. FeRhoNox-1的选择性。FeRhoNox-1仅与Fe2+反应。

保存及运输：-20℃避光干燥保存，至少1年有效。运输：冰袋运输。

二、操作步骤

1.需要自行准备的材料

1.1细胞培养级或超纯DMSO（CAT：#FS0306）【强烈建议将高纯的DMSO分装成单次用量保存在极低温冷冻室内，比如-80℃，避免吸潮。降解的DMSO可能会增加FeRhoNox-1的背景信号】

1.2合适的清洗和观察缓冲液（比如：PBS, pH 7.4；HBSS；等）。[注意]不要含有酚红。

2.探针准备

2.1从冰箱取出FeRhoNox-1，置于室温回温至少30min，将其置于微量离心机内低速离心。将瓶内的粉末离心到管底后，再开盖。

2.2往一管FeRhoNox-1（50μg）内加入109μl高质量DMSO，用枪反复吹吸5次或以上，使其完全溶解即得到1mMFeRhoNox-1储存液。建议单次用完储存液，若实在用不完，请根据单次用量分装，置于-80℃避光保存。用中性缓冲液来稀释储存液。

2.3于正式实验前，用HBSS或其他中性缓冲液来稀释1mMFeRhoNox-1储存液到所需工作浓度（比如：5μM），工作液需现配现用，尽快用完。

3.染色步骤
3.1从玻璃底培养皿上培养的细胞中吸掉培养液。
3.2吸掉上清液，用 HBSS 清洗细胞 2 次。
3.3加入含5μM  FeRhoNox-1的染色工作液，于37℃，5%CO2培养箱中孵育60min。
3.4在荧光显微镜下观察细胞。

4.荧光检测

对于荧光激发：通用的绿色激发滤片比如Cy3或四甲基罗丹明（TMR）检测用的滤片。

对于激光激发：532nm或543nm激光器比较适合。发射波长为570nm左右。

注意事项

1)FeRhoNox-1倾向定位在高尔基体，但也可能检测细胞质池内的Fe2+，目前针对这一点未做明确评估。

2)酸性溶液会氧化FeRhoNox-1，严重影响探针的效率。

3)荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。

4)为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

附录F eRhoNox-1的染色示例

I. HepG2细胞 图3. FeRhoNox-1在HepG2活细胞内的成像检测。①-Fe(II)：细胞未添加亚铁离子（100μM硫酸亚铁铵）；②+Fe(II)：细胞加载亚铁离子；③+Fe(II)+Bpy：细胞加载亚铁离子，之后用加入铁离子螯合剂Bpy。图②荧光增强，而图③荧光降低。此结果与FeRhoNox-1特异性检测Fe(II)的特征一致。