AF594 NHS ester试剂参数以及实验储备溶液的配置过程

AF594 NHS ester染料被优化用于标记蛋白质，特别是抗体。AF594 NHS ester染料的荧光激发和发射zui大值分别为~590 nm和~610 nm。AF594 NHS ester家族从pH 3到11与ph无关。这些光谱特性使这种新的染料家族成为德克萨斯红®和AF594 NHS ester的一个极好的替代品。与TexasRed®相比，AF594 NHS ester更容易与RPE共轭，共轭率更高，得到的RPE-AF594 NHS ester串联具有更好的FRET效率。AF594 NHS ester SE相当稳定，对蛋白质氨基具有良好的反应活性和选择性。本文主要以山羊抗小鼠IgG与AF594 NHS ester SE的结合实验案例进行说明。
一、AF594 NHS ester 基本的数据
CAS号：1638544-48-5
英文名：AF594 NHS ester，AF594 NHS ester, 5-isomer，AF 594 Succinimidyl Ester
中文名：AF594 活性酯，AF594 NHS酯
分子式：C51H67N5O13S2
分子量：1022.23
纯度标准：95%+
外表颜色: 深蓝色晶体
结构式：

AF594 NHS ester结构式

存储条件：-20℃，阴凉，干燥，通风良好的库房
二、实验前储备溶液的制备:（所有未使用的原液应分为一次性等分，并在制备后以-20°C保存。避免反复的冻融循环）
1.蛋白质原液（溶液A）
将100µL反应缓冲液（如1M碳酸钠溶液或1M磷酸盐缓冲液，pH ~9.0）与900µL目标蛋白质溶液（如抗体，蛋白质浓度>2 mg/mL）混合，得到1 mL蛋白质标记原液。
注意事项：
a.蛋白质溶液（溶液A）的pH值应为8.5 ± 0.5。如果蛋白质溶液的pH值低于8.0，则使用1M碳酸氢钠溶液或1M pH 9.0磷酸盐缓冲液将pH值调整到8.0-9.0的范围。
b.蛋白质应溶解在1X磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，pH值为7.2-7.4。如果蛋白质溶解在Tris或甘氨酸缓冲液中，则必须用pH为7.2-7.4的1X PBS进行透析，以去除广泛用于蛋白质沉淀的游离胺或铵盐（如硫酸铵和乙酸铵）。
c.缺损抗体或用牛血清白蛋白（BSA）或明胶稳定的抗体不能很好地标记。叠氮化钠或硫柳汞的存在也可能干扰偶联反应。叠氮化钠或硫柳汞可以通过透析或旋转柱去除，以获得最佳的标记结果。
d.蛋白质浓度小于2 mg/mL时，偶联效率显著降低。为了获得最佳的标记效率，推荐最终的蛋白浓度范围为2-10 mg/mL。
2.原液（溶液B）
iFluor™594 SE原液（溶液B）将无水DMSO加入到iFluor™594 SE的小瓶中，制成10 mM的原液。通过移液或涡旋混合均匀。
注意事项：
在开始结合前准备染料原液（溶液B）。及时使用。染料原液的长期储存可能会降低染料的活性。溶液B可以在冰箱中保存两周。避免冻融循环。
三、样本实验方案
该标记方案是用于山羊抗小鼠IgG与iFluor™594 SE的结合。
1、运行共轭反应
A.以溶液B（染料）/溶液A（蛋白质）的10：1摩尔比为起点：将5µL染料溶液（溶液B）加入到蛋白质溶液(95µL溶液A）中，并有效摇晃。假设蛋白质浓度为10 mg/mL，蛋白质分子量为~200KD，蛋白质浓度为~0.05 mM。
B.在室温下继续旋转或摇晃反应混合物30-60分钟。

图1. HeLa细胞用（微管蛋白+）或不用（微管蛋白-）小鼠抗微管蛋白染色，然后用iFluor™594山羊抗小鼠IgG（左）或AlexaFluor®594山羊抗小鼠IgG（右）观察。
 

AF594是一种明亮的水溶性染料，对4到10范围内的pH变化不敏感，AF594可用于高摩尔染料-蛋白质比的蛋白质标记。由此产生的具有高度标记（DOL）的共轭物不会表现出明显的荧光猝灭，可以提高标记产物的检测限度。
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