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新研博美用于标记的荧光染料Cy3、Cy5、Cy5.5、Cy7、FAM、FITC、Rhodamine B、TAMRA、BHQ
来跟新研博美一起了解关于Super Fluor 488，555, 647, 680, 750活化酯标记抗体的实验
Super Flour 系列（效果同Alexa Fluor 系列）荧光探针，具有更强的荧光强度，更广的pH应用范围（pH4～10）, 更好的抗淬灭性。在生物荧光领域已逐渐替代FITC,Cy3, Cy5, Cy5.5, Cy7等荧光染料。
表 Super Fluor 488，555, 647, 680, 750活化酯的性质参数
原料准备：
A．活性染料 1mg；B．碳酸氢钠 ～84mg；C．抗体纯化树脂P-30／Sephadex G25M／透析袋；D．空柱
5 个；E．收集管 5 个；
注意：纯化的蛋白buffer 中不得含有铵离子或伯铵，因为它们会与蛋白质竞争结合活性染料。不纯的抗体或
者含BSA 或明胶的抗体标记效果不好。低浓度的NaN3(<3mM)或thimerosal（<1mM）不影响偶联效果。
活性染料稳定性与储存：未开封的粉末在避光干燥-20℃可存放6月。其水溶液现配现用不能储存。任何溶解
后的染料最好立即使用；无水的DMSO溶液-20°C保存最多2个星期。
一、实验步骤：
1) 蛋白溶解：用0.1 M NaHCO3 溶解至终浓度为2mg/ml
将1ml 去离子水加入84mgNaHCO3瓶中，配成1M 的碳酸氢钠溶液。振荡或吹打至完全溶解。该溶液pH
约8.3，2～6℃保存可用2 星期；若抗体是溶液，将抗体稀释至2mg/ml，再加入1/10 体积的上述碳酸氢钠
溶液；若抗体是冻干粉，将1M 碳酸氢钠溶液用10 倍去离子水稀释成0.1M 后，用其将抗体溶成2mg/ml 的
溶液；
2）染料溶解：染料固体粉末从冰箱放入干燥器中慢慢升至常温后，用无水DMSO将染料配置浓度为1 mg/mL。
3）标记：在1mL蛋白溶液中缓慢加入适量染料溶液，（蛋白:染料摩尔比=1:20～50；质量比可在以下范围
内优化 10～200ug Super dye每毫克IgG抗体）。同时在暗处常温缓慢搅拌1小时。也可以直接将蛋白溶液
直接加入染料的固体粉末的试剂瓶中，同时在暗处常温缓慢搅拌1小时。
4）纯化：选择下面三种方式纯化后，产品冷冻干燥成粉末或在0.01 M PBS/2mM叠氮化钠溶液中，-20℃避
光储存。
5）贮存：标记好的蛋白贮存于2～6℃，避光。若纯化的蛋白偶联物浓度小于1mg/ml，加入BSA 或其他稳
定蛋白1～10mg/ml。在2mM 叠氮钠存在的情况下，2～6 度可保存几个月。保存更长时间，则需分装后-20℃
保存。避免反复冻融，避光保存。
纯化方法1. 透析法：
1）简单纯化可用100 mL 0.15 M NaCl 溶液常温避光透析4次,每次4小时除去未标记上的染料。
2）在4°C用新鲜的1 L 0.15 M NaCl 溶液再避光透析过夜。
3）用100 mL of 0.01 M PBS/ 0.01% 叠氮化钠溶液常温避光透析4小时, 在4°C常温避光再次透析过夜。
4）用0.22 μm注射器过滤头过滤抗体溶液。
纯化方法2. P-30柱子
1）0.5g p-30凝胶加入9mlPBS(pH=7.4)室温过夜放置；次日，弃上清；真空抽滤5min；
2）加入9mlPBS,轻柔震荡均匀，放置20min后，去除上清液
3）再重复2
4）将树脂柱放入一个13×100mm 的玻璃管柱中，每个柱子加入1.5ml.(不要多加)，填的要均匀不能有气泡。
具体方法是：搅动纯化树脂（组分C），加入1.0ml 悬浮液至空柱中静置；全部下沉后再加入0.5ml树脂至床
体积为～1.5ml盖上盖子，可以室温保存。
5) 将树脂柱上下端的口打开，放入10ml离心管中由于重力水自然流下，用垂直转子1100g 离心3min，rpm 与
相对离心力g 的换算公式如下：相对离心力g=(1.12×10-5)(rpm)2(半径cm)；离心后静置待缓冲液全部流出，
弃去缓冲液，保留收集管（若没有垂直转子，角转子也可）；
6) 换上干净的离心管，将标记的蛋白反应液200μl逐滴加入树脂柱的中心部位，使溶液被吸入胶床中；
7) 将树脂柱放入空的收集管中，1100g 离心5min；
8）离心后，收集管内是标记好的蛋白，溶在100μlPBS 中，pH7.2，包括2mM 的叠氮钠。未结合的染料保
留在柱中，弃去树脂柱；
注意事项：配置柱子时，用较细的小瓶，每个小瓶配置2个柱子。便于去除水分。填柱子时，加到1.5ml, 尽量不要多加，离心时间按照说明书1000g/3min，不要随便更改。
纯化方法3. PD-10 column (Sephadex G25M)
3.1. 装填柱层析分离吸附柱
1) 提前用去离子水浸泡葡聚糖Sephadex过夜(1g 配5mLH2O)，使其溶胀，打开孔状结构. 2) 湿法装柱：(装填过程中确保PBS(10mM, pH=7.4)液面比Sephadex高，以防混入空气而产生气泡)先在柱
子（13×100mm）内注入3/4左右的PBS，而后加入Sephadex /PBS溶液；分批次、缓慢加入柱子内，
最后用塑料滴管吸取，沿着柱子四壁旋转，逐步、缓慢地加入，装填至近满，留下约3cm的空间以待注
入荧光标记蛋白溶液；
3) 在装填的整个过程中打开活塞(淋出液用大烧杯承接)，同时用玻璃棒+橡胶塞从下到上轻轻敲打柱子，使
Sephadex装填紧密，注意使柱子内不得有气泡，不得有断层，使柱子竖直，确保顶部端面水平；(故滴
加Sephadex时应旋转加入，不得直接滴加，以免激起柱顶层)
4) 装填完柱子后，用塑料滴管吸取PBS，沿管口四壁旋转着缓慢加入，使PBS过一遍
柱子，而后将PBS注入Sephadex顶部，以隔绝空气，以免在柱内产生气泡，关闭
末端活塞；
3.2过柱层析分离吸附柱(避光)
1) 打开柱子末端活塞，缓慢放出柱子顶层的PBS，待PBS液面刚与Sephadex柱子端
面相平时，立即关闭活塞；
注意不要使PBS液面低于Sephadex柱子端面，以免混入空气而在柱子内产生气泡；
立即用塑料滴管吸取荧光蛋白溶液，沿柱子四壁旋转，缓慢加入(全部加完,不要搅动Sephadex随时保持
其端面水平)
2) 待荧光蛋白溶液全部加完后，打开活塞，使荧光蛋白溶液流入柱子中；
当荧光蛋白溶液的液面刚刚完全进入柱子时，立即用塑料滴管加入PBS(缓慢沿管子四壁旋转加入)，在荧
光蛋白溶液过柱子的过程中注意随时添加PBS，确保Sephadex端面不与空气接触；
3) 用烧杯承接最初的淋出液，几分钟后带颜色的溶液便从柱子顶部往下流，而后分作三段；
柱子下端(靠近活塞)：荧光标记的蛋白，带颜色，流速较快；
柱子中间：空白无颜色部分，两者的过渡区域；
柱子上端：未与蛋白反应的染料，带颜色，流速较慢；
4) 待下端带颜色的荧光蛋白溶液的前沿进入活塞时，立即用5mL冻存管(锡箔纸避光)承接此淋出液(此即荧
光蛋白溶液)；直至荧光蛋白溶液的尾部进入活塞口为止。
5）用10倍柱体积的PBS洗掉未反应的染料，使柱子再生后重复使用。长时间储存柱子可用含0.05％NaN3
的PBS溶液平衡柱子后，密闭封严在2～8℃储存。
二．计算标记比例F/P值：
对于IgG 等大多数抗体来说，摩尔吸光系数为203000，F/P值在4～9 之间是最合适。
1. Super Flour 488标记蛋白F/P值计算：
1）用PBS 精确倍数稀释定量的少许纯化过的偶联蛋白，在1cm比色皿中测定280nm和494nm的光吸收；
2）计算样品中的蛋白浓度：蛋白摩尔浓度=(A280-(A494×0.11))×稀释倍数/203000
3）计算标记比例： 每摩尔蛋白结合的染料摩尔数=A494×稀释倍数/(71000×蛋白摩尔浓度)
2. Super Flour 555标记蛋白F/P值计算：
1）用PBS 精确倍数稀释定量的少许纯化过的偶联蛋白，在1cm比色皿中测定280nm和555nm的光吸收；
2）计算样品中的蛋白浓度：蛋白摩尔浓度=(A280-(A555×0.08))×稀释倍数/203000
3）计算标记比例： 每摩尔蛋白结合的染料摩尔数=A555×稀释倍数/(150000×蛋白摩尔浓度)
3. Super Flour 647标记蛋白F/P值计算：
1）用PBS 精确倍数稀释定量的少许纯化过的偶联蛋白，在1cm比色皿中测定280nm和650nm的光吸收；
2）计算样品中的蛋白浓度：蛋白摩尔浓度=(A280-(A650×0.03))×稀释倍数/203000
3）计算标记比例： 每摩尔蛋白结合的染料摩尔数=A650×稀释倍数/(239000×蛋白摩尔浓度)
4. Super Flour 680标记蛋白F/P值计算：
1）用PBS 精确倍数稀释定量的少许纯化过的偶联蛋白，在1cm比色皿中测定280nm和680nm的光吸收；
2）计算样品中的蛋白浓度：蛋白摩尔浓度=(A280-(A650×0.05))×稀释倍数/203000
3）计算标记比例： 每摩尔蛋白结合的染料摩尔数=A650×稀释倍数/(184000×蛋白摩尔浓度)
5. Super Flour 750标记蛋白F/P值计算：
1）用PBS 精确倍数稀释定量的少许纯化过的偶联蛋白，在1cm比色皿中测定280nm和750nm的光吸收；
2）计算样品中的蛋白浓度：蛋白摩尔浓度=(A280-(A750×0.04))×稀释倍数/203000
3）计算标记比例： 每摩尔蛋白结合的染料摩尔数=A750×稀释倍数/(240000×蛋白摩尔浓度)
三、常见问题：
1．标记效率低――计算结果显示每摩尔145,000 MW 的蛋白标记的荧光团少于4 摩尔, 可能有以下原因：
l 缓冲液中含有痕量伯铵成分，与染料反应降低了标记效率。如果蛋白已经溶于含氨基的缓冲液（如Tris
或氨基乙酸），标记前用PBS透析。
l 蛋白含量较低 (≤1 mg/mL)会影响标记效率。
l 标记步骤中加入碳酸氢钠的作用是将反应混合物的pH升高至～8，因为在弱碱性环境中标记反应的效率
最高。如果蛋白溶液的缓冲范围在低pH，加入重碳酸盐也无法将pH调节至最适水平。要么加大重碳酸
盐的量，要么将缓冲液换成PBS，或用0.1 M碳酸氢钠透析等。
l 研究显示pH升至9.0～9.4，标记效率和标记速度（只需10min）明显改善。
l 不同抗体与荧光团的反应速率不同，染料标记后保留的生物活性程度也不同，因此标准步骤也不是总有
最好的标记结果。为增加标记率，可以对同一样品进行再标记，或减少蛋白的量加大染料的量重新标记。
有研究者在室温孵育1小时后再4℃孵育过夜，情况有所改善。
2．过标记——计算结果显示每摩尔145,000 MW 的蛋白标记的荧光团大于10摩尔。虽然过标记的蛋白也可
以使用，但可能会引起蛋白的聚集、降低抗体结合抗原的特异性，这些都会造成非特异性结合。过标记
还会引起荧光淬灭。可以增加蛋白或减少反应时间。
3．未结合染料难以去除――尽管大部分时候用分离柱可以较好的纯化蛋白偶联物，但仍可能会有痕量的游
离染料留在偶联物溶液中，会使标记计算的值偏高。可用分离柱再次分离或透析去除。
蛋白或蛋白偶联物无法洗脱――不要再加缓冲液，只需再次离心一次或几次。
小动物活体成像领域的应用
活体动物体内成像技术是指应用影像学方法，对活体状态下的生物过程进行组织、细胞和分子水平的定
性和定量研究的技术。小动物活体成像是近年来在生物医药方面非常活跃和前沿的领域，在研究细胞行为，
药物活性和代谢，疾病的进展等方向取得了革命性的进步。分为生物发光成像（以Caliper和Xengon仪器为
代表）和荧光成像（以KODAK和CRI仪器为代表）。
公司提供近红外的荧光成像染料及其与小分子药物和生物大分子的荧光标记服务，并提供生物发光底物
虫荧光素（D-luciferin）和
Super Flour 系列（效果同Alexa Fluor 系列）荧光探针，具有更强的荧光强度，更广的pH应用范围（pH4～10）, 更好的抗淬灭性。在生物荧光领域已逐渐替代FITC,Cy3, Cy5, Cy5.5, Cy7等荧光染料。
表 Super Fluor 488，555, 647, 680, 750活化酯的性质参数
原料准备：
A．活性染料 1mg；B．碳酸氢钠 ～84mg；C．抗体纯化树脂P-30／Sephadex G25M／透析袋；D．空柱
5 个；E．收集管 5 个；
注意：纯化的蛋白buffer 中不得含有铵离子或伯铵，因为它们会与蛋白质竞争结合活性染料。不纯的抗体或
者含BSA 或明胶的抗体标记效果不好。低浓度的NaN3(<3mM)或thimerosal（<1mM）不影响偶联效果。
活性染料稳定性与储存：未开封的粉末在避光干燥-20℃可存放6月。其水溶液现配现用不能储存。任何溶解
后的染料最好立即使用；无水的DMSO溶液-20°C保存最多2个星期。
一、实验步骤：
1) 蛋白溶解：用0.1 M NaHCO3 溶解至终浓度为2mg/ml
将1ml 去离子水加入84mgNaHCO3瓶中，配成1M 的碳酸氢钠溶液。振荡或吹打至完全溶解。该溶液pH
约8.3，2～6℃保存可用2 星期；若抗体是溶液，将抗体稀释至2mg/ml，再加入1/10 体积的上述碳酸氢钠
溶液；若抗体是冻干粉，将1M 碳酸氢钠溶液用10 倍去离子水稀释成0.1M 后，用其将抗体溶成2mg/ml 的
溶液；
2）染料溶解：染料固体粉末从冰箱放入干燥器中慢慢升至常温后，用无水DMSO将染料配置浓度为1 mg/mL。
3）标记：在1mL蛋白溶液中缓慢加入适量染料溶液，（蛋白:染料摩尔比=1:20～50；质量比可在以下范围
内优化 10～200ug Super dye每毫克IgG抗体）。同时在暗处常温缓慢搅拌1小时。也可以直接将蛋白溶液
直接加入染料的固体粉末的试剂瓶中，同时在暗处常温缓慢搅拌1小时。
4）纯化：选择下面三种方式纯化后，产品冷冻干燥成粉末或在0.01 M PBS/2mM叠氮化钠溶液中，-20℃避
光储存。
5）贮存：标记好的蛋白贮存于2～6℃，避光。若纯化的蛋白偶联物浓度小于1mg/ml，加入BSA 或其他稳
定蛋白1～10mg/ml。在2mM 叠氮钠存在的情况下，2～6 度可保存几个月。保存更长时间，则需分装后-20℃
保存。避免反复冻融，避光保存。
纯化方法1. 透析法：
1）简单纯化可用100 mL 0.15 M NaCl 溶液常温避光透析4次,每次4小时除去未标记上的染料。
2）在4°C用新鲜的1 L 0.15 M NaCl 溶液再避光透析过夜。
3）用100 mL of 0.01 M PBS/ 0.01% 叠氮化钠溶液常温避光透析4小时, 在4°C常温避光再次透析过夜。
4）用0.22 μm注射器过滤头过滤抗体溶液。
纯化方法2. P-30柱子
1）0.5g p-30凝胶加入9mlPBS(pH=7.4)室温过夜放置；次日，弃上清；真空抽滤5min；
2）加入9mlPBS,轻柔震荡均匀，放置20min后，去除上清液
3）再重复2
4）将树脂柱放入一个13×100mm 的玻璃管柱中，每个柱子加入1.5ml.(不要多加)，填的要均匀不能有气泡。
具体方法是：搅动纯化树脂（组分C），加入1.0ml 悬浮液至空柱中静置；全部下沉后再加入0.5ml树脂至床
体积为～1.5ml盖上盖子，可以室温保存。
5) 将树脂柱上下端的口打开，放入10ml离心管中由于重力水自然流下，用垂直转子1100g 离心3min，rpm 与
相对离心力g 的换算公式如下：相对离心力g=(1.12×10-5)(rpm)2(半径cm)；离心后静置待缓冲液全部流出，
弃去缓冲液，保留收集管（若没有垂直转子，角转子也可）；
6) 换上干净的离心管，将标记的蛋白反应液200μl逐滴加入树脂柱的中心部位，使溶液被吸入胶床中；
7) 将树脂柱放入空的收集管中，1100g 离心5min；
8）离心后，收集管内是标记好的蛋白，溶在100μlPBS 中，pH7.2，包括2mM 的叠氮钠。未结合的染料保
留在柱中，弃去树脂柱；
注意事项：配置柱子时，用较细的小瓶，每个小瓶配置2个柱子。便于去除水分。填柱子时，加到1.5ml, 尽量不要多加，离心时间按照说明书1000g/3min，不要随便更改。
纯化方法3. PD-10 column (Sephadex G25M)
3.1. 装填柱层析分离吸附柱
1) 提前用去离子水浸泡葡聚糖Sephadex过夜(1g 配5mLH2O)，使其溶胀，打开孔状结构. 2) 湿法装柱：(装填过程中确保PBS(10mM, pH=7.4)液面比Sephadex高，以防混入空气而产生气泡)先在柱
子（13×100mm）内注入3/4左右的PBS，而后加入Sephadex /PBS溶液；分批次、缓慢加入柱子内，
最后用塑料滴管吸取，沿着柱子四壁旋转，逐步、缓慢地加入，装填至近满，留下约3cm的空间以待注
入荧光标记蛋白溶液；
3) 在装填的整个过程中打开活塞(淋出液用大烧杯承接)，同时用玻璃棒+橡胶塞从下到上轻轻敲打柱子，使
Sephadex装填紧密，注意使柱子内不得有气泡，不得有断层，使柱子竖直，确保顶部端面水平；(故滴
加Sephadex时应旋转加入，不得直接滴加，以免激起柱顶层)
4) 装填完柱子后，用塑料滴管吸取PBS，沿管口四壁旋转着缓慢加入，使PBS过一遍
柱子，而后将PBS注入Sephadex顶部，以隔绝空气，以免在柱内产生气泡，关闭
末端活塞；
3.2过柱层析分离吸附柱(避光)
1) 打开柱子末端活塞，缓慢放出柱子顶层的PBS，待PBS液面刚与Sephadex柱子端
面相平时，立即关闭活塞；
注意不要使PBS液面低于Sephadex柱子端面，以免混入空气而在柱子内产生气泡；
立即用塑料滴管吸取荧光蛋白溶液，沿柱子四壁旋转，缓慢加入(全部加完,不要搅动Sephadex随时保持
其端面水平)
2) 待荧光蛋白溶液全部加完后，打开活塞，使荧光蛋白溶液流入柱子中；
当荧光蛋白溶液的液面刚刚完全进入柱子时，立即用塑料滴管加入PBS(缓慢沿管子四壁旋转加入)，在荧
光蛋白溶液过柱子的过程中注意随时添加PBS，确保Sephadex端面不与空气接触；
3) 用烧杯承接最初的淋出液，几分钟后带颜色的溶液便从柱子顶部往下流，而后分作三段；
柱子下端(靠近活塞)：荧光标记的蛋白，带颜色，流速较快；
柱子中间：空白无颜色部分，两者的过渡区域；
柱子上端：未与蛋白反应的染料，带颜色，流速较慢；
4) 待下端带颜色的荧光蛋白溶液的前沿进入活塞时，立即用5mL冻存管(锡箔纸避光)承接此淋出液(此即荧
光蛋白溶液)；直至荧光蛋白溶液的尾部进入活塞口为止。
5）用10倍柱体积的PBS洗掉未反应的染料，使柱子再生后重复使用。长时间储存柱子可用含0.05％NaN3
的PBS溶液平衡柱子后，密闭封严在2～8℃储存。
二．计算标记比例F/P值：
对于IgG 等大多数抗体来说，摩尔吸光系数为203000，F/P值在4～9 之间是最合适。
1. Super Flour 488标记蛋白F/P值计算：
1）用PBS 精确倍数稀释定量的少许纯化过的偶联蛋白，在1cm比色皿中测定280nm和494nm的光吸收；
2）计算样品中的蛋白浓度：蛋白摩尔浓度=(A280-(A494×0.11))×稀释倍数/203000
3）计算标记比例： 每摩尔蛋白结合的染料摩尔数=A494×稀释倍数/(71000×蛋白摩尔浓度)
2. Super Flour 555标记蛋白F/P值计算：
1）用PBS 精确倍数稀释定量的少许纯化过的偶联蛋白，在1cm比色皿中测定280nm和555nm的光吸收；
2）计算样品中的蛋白浓度：蛋白摩尔浓度=(A280-(A555×0.08))×稀释倍数/203000
3）计算标记比例： 每摩尔蛋白结合的染料摩尔数=A555×稀释倍数/(150000×蛋白摩尔浓度)
3. Super Flour 647标记蛋白F/P值计算：
1）用PBS 精确倍数稀释定量的少许纯化过的偶联蛋白，在1cm比色皿中测定280nm和650nm的光吸收；
2）计算样品中的蛋白浓度：蛋白摩尔浓度=(A280-(A650×0.03))×稀释倍数/203000
3）计算标记比例： 每摩尔蛋白结合的染料摩尔数=A650×稀释倍数/(239000×蛋白摩尔浓度)
4. Super Flour 680标记蛋白F/P值计算：
1）用PBS 精确倍数稀释定量的少许纯化过的偶联蛋白，在1cm比色皿中测定280nm和680nm的光吸收；
2）计算样品中的蛋白浓度：蛋白摩尔浓度=(A280-(A650×0.05))×稀释倍数/203000
3）计算标记比例： 每摩尔蛋白结合的染料摩尔数=A650×稀释倍数/(184000×蛋白摩尔浓度)
5. Super Flour 750标记蛋白F/P值计算：
1）用PBS 精确倍数稀释定量的少许纯化过的偶联蛋白，在1cm比色皿中测定280nm和750nm的光吸收；
2）计算样品中的蛋白浓度：蛋白摩尔浓度=(A280-(A750×0.04))×稀释倍数/203000
3）计算标记比例： 每摩尔蛋白结合的染料摩尔数=A750×稀释倍数/(240000×蛋白摩尔浓度)
三、常见问题：
1．标记效率低――计算结果显示每摩尔145,000 MW 的蛋白标记的荧光团少于4 摩尔, 可能有以下原因：
l 缓冲液中含有痕量伯铵成分，与染料反应降低了标记效率。如果蛋白已经溶于含氨基的缓冲液（如Tris
或氨基乙酸），标记前用PBS透析。
l 蛋白含量较低 (≤1 mg/mL)会影响标记效率。
l 标记步骤中加入碳酸氢钠的作用是将反应混合物的pH升高至～8，因为在弱碱性环境中标记反应的效率
最高。如果蛋白溶液的缓冲范围在低pH，加入重碳酸盐也无法将pH调节至最适水平。要么加大重碳酸
盐的量，要么将缓冲液换成PBS，或用0.1 M碳酸氢钠透析等。
l 研究显示pH升至9.0～9.4，标记效率和标记速度（只需10min）明显改善。
l 不同抗体与荧光团的反应速率不同，染料标记后保留的生物活性程度也不同，因此标准步骤也不是总有
最好的标记结果。为增加标记率，可以对同一样品进行再标记，或减少蛋白的量加大染料的量重新标记。
有研究者在室温孵育1小时后再4℃孵育过夜，情况有所改善。
2．过标记——计算结果显示每摩尔145,000 MW 的蛋白标记的荧光团大于10摩尔。虽然过标记的蛋白也可
以使用，但可能会引起蛋白的聚集、降低抗体结合抗原的特异性，这些都会造成非特异性结合。过标记
还会引起荧光淬灭。可以增加蛋白或减少反应时间。
3．未结合染料难以去除――尽管大部分时候用分离柱可以较好的纯化蛋白偶联物，但仍可能会有痕量的游
离染料留在偶联物溶液中，会使标记计算的值偏高。可用分离柱再次分离或透析去除。
蛋白或蛋白偶联物无法洗脱――不要再加缓冲液，只需再次离心一次或几次。
小动物活体成像领域的应用
活体动物体内成像技术是指应用影像学方法，对活体状态下的生物过程进行组织、细胞和分子水平的定
性和定量研究的技术。小动物活体成像是近年来在生物医药方面非常活跃和前沿的领域，在研究细胞行为，
药物活性和代谢，疾病的进展等方向取得了革命性的进步。分为生物发光成像（以Caliper和Xengon仪器为
代表）和荧光成像（以KODAK和CRI仪器为代表）。
公司提供近红外的荧光成像染料及其与小分子药物和生物大分子的荧光标记服务，并提供生物发光底物
虫荧光素（D-luciferin）和
AF594 NHS ester试剂参数以及实验储备溶液的配置过程
2022-11-29
一、AF594 NHS ester 基本的数据
CAS号：1638544-48-5
英文名：AF594 NHS ester，AF594 NHS ester, 5-isomer，AF 594 Succinimidyl Ester
中文名：AF594 活性酯，AF594 NHS酯
分子式：C51H67N5O13S2
分子量：1022.23
纯度标准：95%+
外表颜色: 深蓝色晶体
结构式：
AF594 NHS ester结构式
存储条件：-20℃，阴凉，干燥，通风良好的库房
二、实验前储备溶液的制备:（所有未使用的原液应分为一次性等分，并在制备后以-20°C保存。避免反复的冻融循环）
1.蛋白质原液（溶液A）
将100µL反应缓冲液（如1M碳酸钠溶液或1M磷酸盐缓冲液，pH ~9.0）与900µL目标蛋白质溶液（如抗体，蛋白质浓度>2 mg/mL）混合，得到1 mL蛋白质标记原液。
注意事项：
a.蛋白质溶液（溶液A）的pH值应为8.5 ± 0.5。如果蛋白质溶液的pH值低于8.0，则使用1M碳酸氢钠溶液或1M pH 9.0磷酸盐缓冲液将pH值调整到8.0-9.0的范围。
b.蛋白质应溶解在1X磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，pH值为7.2-7.4。如果蛋白质溶解在Tris或甘氨酸缓冲液中，则必须用pH为7.2-7.4的1X PBS进行透析，以去除广泛用于蛋白质沉淀的游离胺或铵盐（如硫酸铵和乙酸铵）。
c.缺损抗体或用牛血清白蛋白（BSA）或明胶稳定的抗体不能很好地标记。叠氮化钠或硫柳汞的存在也可能干扰偶联反应。叠氮化钠或硫柳汞可以通过透析或旋转柱去除，以获得最佳的标记结果。
d.蛋白质浓度小于2 mg/mL时，偶联效率显著降低。为了获得最佳的标记效率，推荐最终的蛋白浓度范围为2-10 mg/mL。
2.原液（溶液B）
iFluor™594 SE原液（溶液B）将无水DMSO加入到iFluor™594 SE的小瓶中，制成10 mM的原液。通过移液或涡旋混合均匀。
注意事项：
在开始结合前准备染料原液（溶液B）。及时使用。染料原液的长期储存可能会降低染料的活性。溶液B可以在冰箱中保存两周。避免冻融循环。
三、样本实验方案
该标记方案是用于山羊抗小鼠IgG与iFluor™594 SE的结合。
1、运行共轭反应
A.以溶液B（染料）/溶液A（蛋白质）的10：1摩尔比为起点：将5µL染料溶液（溶液B）加入到蛋白质溶液(95µL溶液A）中，并有效摇晃。假设蛋白质浓度为10 mg/mL，蛋白质分子量为~200KD，蛋白质浓度为~0.05 mM。
B.在室温下继续旋转或摇晃反应混合物30-60分钟。
图1. HeLa细胞用（微管蛋白+）或不用（微管蛋白-）小鼠抗微管蛋白染色，然后用iFluor™594山羊抗小鼠IgG（左）或AlexaFluor®594山羊抗小鼠IgG（右）观察。
AF594是一种明亮的水溶性染料，对4到10范围内的pH变化不敏感，AF594可用于高摩尔染料-蛋白质比的蛋白质标记。由此产生的具有高度标记（DOL）的共轭物不会表现出明显的荧光猝灭，可以提高标记产物的检测限度。
陕西新研博美生物科技有限公司提供各种规格的荧光AF染料包括AF430，AF647，AF568，AF488等一系列的。对于荧光AF染料其是具有磺化基团的荧光物质。AF染料带负电荷，具有亲水性高、亮度高、光稳定性强、仪器相容性好、对pH不敏感等特点。AF染料的激发峰适用于激光光谱，发射峰较窄，抗猝灭性强，有利于多种荧光标记。
温馨提示：以上仅用于科学研究或者工业应用等非医疗目的，不可用于人类或动物的临床或诊断，非药用，非食用。部分资料来源于网上，如有侵权，请立即联系我们进行删除。
一、AF594 NHS ester 基本的数据
CAS号：1638544-48-5
英文名：AF594 NHS ester，AF594 NHS ester, 5-isomer，AF 594 Succinimidyl Ester
中文名：AF594 活性酯，AF594 NHS酯
分子式：C51H67N5O13S2
分子量：1022.23
纯度标准：95%+
外表颜色: 深蓝色晶体
结构式：
AF594 NHS ester结构式
存储条件：-20℃，阴凉，干燥，通风良好的库房
二、实验前储备溶液的制备:（所有未使用的原液应分为一次性等分，并在制备后以-20°C保存。避免反复的冻融循环）
1.蛋白质原液（溶液A）
将100µL反应缓冲液（如1M碳酸钠溶液或1M磷酸盐缓冲液，pH ~9.0）与900µL目标蛋白质溶液（如抗体，蛋白质浓度>2 mg/mL）混合，得到1 mL蛋白质标记原液。
注意事项：
a.蛋白质溶液（溶液A）的pH值应为8.5 ± 0.5。如果蛋白质溶液的pH值低于8.0，则使用1M碳酸氢钠溶液或1M pH 9.0磷酸盐缓冲液将pH值调整到8.0-9.0的范围。
b.蛋白质应溶解在1X磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，pH值为7.2-7.4。如果蛋白质溶解在Tris或甘氨酸缓冲液中，则必须用pH为7.2-7.4的1X PBS进行透析，以去除广泛用于蛋白质沉淀的游离胺或铵盐（如硫酸铵和乙酸铵）。
c.缺损抗体或用牛血清白蛋白（BSA）或明胶稳定的抗体不能很好地标记。叠氮化钠或硫柳汞的存在也可能干扰偶联反应。叠氮化钠或硫柳汞可以通过透析或旋转柱去除，以获得最佳的标记结果。
d.蛋白质浓度小于2 mg/mL时，偶联效率显著降低。为了获得最佳的标记效率，推荐最终的蛋白浓度范围为2-10 mg/mL。
2.原液（溶液B）
iFluor™594 SE原液（溶液B）将无水DMSO加入到iFluor™594 SE的小瓶中，制成10 mM的原液。通过移液或涡旋混合均匀。
注意事项：
在开始结合前准备染料原液（溶液B）。及时使用。染料原液的长期储存可能会降低染料的活性。溶液B可以在冰箱中保存两周。避免冻融循环。
三、样本实验方案
该标记方案是用于山羊抗小鼠IgG与iFluor™594 SE的结合。
1、运行共轭反应
A.以溶液B（染料）/溶液A（蛋白质）的10：1摩尔比为起点：将5µL染料溶液（溶液B）加入到蛋白质溶液(95µL溶液A）中，并有效摇晃。假设蛋白质浓度为10 mg/mL，蛋白质分子量为~200KD，蛋白质浓度为~0.05 mM。
B.在室温下继续旋转或摇晃反应混合物30-60分钟。
图1. HeLa细胞用（微管蛋白+）或不用（微管蛋白-）小鼠抗微管蛋白染色，然后用iFluor™594山羊抗小鼠IgG（左）或AlexaFluor®594山羊抗小鼠IgG（右）观察。
AF594是一种明亮的水溶性染料，对4到10范围内的pH变化不敏感，AF594可用于高摩尔染料-蛋白质比的蛋白质标记。由此产生的具有高度标记（DOL）的共轭物不会表现出明显的荧光猝灭，可以提高标记产物的检测限度。
陕西新研博美生物科技有限公司提供各种规格的荧光AF染料包括AF430，AF647，AF568，AF488等一系列的。对于荧光AF染料其是具有磺化基团的荧光物质。AF染料带负电荷，具有亲水性高、亮度高、光稳定性强、仪器相容性好、对pH不敏感等特点。AF染料的激发峰适用于激光光谱，发射峰较窄，抗猝灭性强，有利于多种荧光标记。
温馨提示：以上仅用于科学研究或者工业应用等非医疗目的，不可用于人类或动物的临床或诊断，非药用，非食用。部分资料来源于网上，如有侵权，请立即联系我们进行删除。
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